Подсолнечный жмых — побочный продукт маслоэкстракционного производства, получаемый после извлечения масла из семян масличных растений. По аминокислотному составу и биохимической ценности белки подсолнечного жмыха превосходят белки зерновых злаков: они содержат больше лизина, метионина, цистина и триптофана [1].
Значительно больше в них также кальция и фосфора. Подсолнечный жмых беден каротином, но богат витаминами группы В [3,4,5]. Особенности технологического процесса на маслодобывающих прессовых предприятиях — очистка семян от примесей, обрушивание и отделение плодовой оболочки, а также измельчение, нагрев измельченного материала, отжим масла, и как следствие, глубокая денатурация белков семян — исключают возможность получения из них пищевых белковых продуктов без дополнительной обработки, повышающей биологическую ценность и улучшающей технологические характеристики белков. [2,6]. Для направленного регулирования функциональных свойств белков и повышения биологической ценности применяют различные методы обработки: термоденатурацию, химическую и ферментную модификации.
[6,7] В настоящее время наибольший интерес представляет биомодификация с использованием растительных и микробных протеаз. Ферменты позволяют в мягких технологических режимах и с использованием природных агентов воздействовать на исходные субстраты, получая оптимальные результаты при минимальных затратах (в сравнении с термическими и химическими воздействиями) [8,9,10].
Цель данной работы — сравнение влияния ферментативной модификации белковых изолятов, полученных из подсолнечного жмыха, на их фракционный состав. Объектом исследования служил белковый изолят, полученный по модифицированному способу [11] из подсолнечного жмыха, отобранного на маслопрессовом предприятии ООО «Светлый путь», (ст. Платнировская Краснодарского края).
В качестве ферментных препаратов растительной и микробной природы использовали соответственно вытяжку ферментов пророщенных семян подсолнечника (РП) и подсырную молочную сыворотку (ПМС). Для приготовления ферментной вытяжки РП поверхность семян подсолнечника обеззараживали 0,01 % раствором сорбиновой кислоты в соотношении 1:2, увлажняли до влажности 150 % (гидромодуль 1:3), затем проращивали при температуре 270С в течение 72 часов. Пророщенные семена измельчали и заливали дистиллированной водой в соотношении 1:5 по массе и выдерживали при температуре 4–60С в течение 60 мин. Полученную суспензию фильтровали. Фильтрат использовали в качестве препарата РП с высокой протеиназной активностью, которым обрабатывали исследуемый белковый изолят из подсолнечного жмыха. В качестве источника микробных протеаз использовали подсырную молочную сыворотку (ГОСТ Р 53438–2009), полученную на сыродельном комбинате «Ленинградский» (ст. Ленинградская, Краснодарский край). В таблице 1 представлен химический состав подсырной молочной сыворотки, полученной при производстве сыра Российский (ГОСТ 11041–88).
Анализ данных показывает, что за счет содержания поваренной соли в подсырной соленой молочной сыворотки содержится значительное количество сухих веществ. Так же благодаря содержанию поваренной соли, которая является естественным консервантом, соленая сыворотка может храниться достаточное время, без значительного ухудшения качества. В результате предварительных экспериментов были определены оптимальные условия модификации: температура 25–350С и время экспозиции 45–60 минут. Модификацию белкового изолята проводили экзопротеазами по трем вариантам: ферментной вытяжкой из пророщенных семян подсолнечника (РП); микробными ферментами подсырной молочной сыворотки (включая сычужные ферменты сыворотки) (ПМС), а также совместным использованием растительных и микробных ферментов (СиРП).
Количественную оценку распределения электрофоретических фракции белковых изолятов проводили методом капиллярного электрофореза на анализаторе Капель — 103Р (фирма «Люмикс», Санкт-Петербург) [12].
Качественную оценку белковых фракций до и после ферментативных модификаций проводили методом капиллярного электрофореза, оценивая площадь пиков на хроматограммах. Электрофоретические спектры, белкового изолята до модификации характеризуются семью близкими по площади фракциями — площади их пиков колеблются от 0,1129 до 0,6771 mAU×сек .
Преобладает фракция, пик которой, появляется на хроматограмме на 17 минуте, площадью 32, 4 % от абсолютной площади всех фракций пробы. Первая фракция, представленная тремя пиками общей площадью 18,7 %, выходит в хроматограмме на 10 минуте. Остальные минорные фракции присутствуют в минимальных количествах и представлены однотипными пиками, появляющимися на хроматограмме на 11, 20 и 22 минутах и имеющими относительные площади 12,09 %, 14,11 % и 11,34 %, соответственно. На двадцать четвертой минуте выходит заключительная фракция, занимающая 9,01 % от общей площади хроматограммы. Общая площадь пиков контрольного образца составляет 2,089 mAU×сек.
Как следует из полученных хроматограмм, электрофоретических фракций модифицированных белковых изолятов, существенно отличаются от исходных белковых изолятов. Так число пиков возрастает с 11, площадью 2,089 mAU×сек, для немодифицированного белкового изолята и до 21 с площадью 24,203 mAU×сек для белкового изолята, модифицированного СиРП. Хроматограмма белков, модифицированных РП, показала наличие 11 фракций, представленных 17 пиками (общей площадью 39,65 mAU×сек), в то время, как хроматограмма белкового изолята, модифицированного ПМС, показала 8 фракций и 19 пиков (общей площадью 28,73 mA×Uсек), а хроматограмма комплексной ферментативной модификации — 13 фракций и 21 пик (общей площадью 24,20 mAU×сек). Таким образом, комплексная ферментативная модификация и модификация РП привела к увеличению скорости разделения пиков на 6 минут, по сравнению с нативным белковым продуктом, а модификация ПМС сократила время на 4,5 минуты. Для белков, модифицированных РП, время удерживания трех пиков первой высокомолекулярной фракции уменьшилось на 3 минуты, а при комплексной модификации — 5 пиков на 4,5 минуты.
Таким образом, комплексная модификация вызвала дифференциацию первой фракции с трех пиков с общей относительной площадью 18,7 %, до пяти — площадью 13,6 %, от общей относительной площади пиков фракций соответствующего белкового продукта. Хромотограмма белкового продукта, модифицированного отдельно ПМС, характеризуется меньшим количеством фракций (на 3 фракции) и временем удерживания пиков (на 6 минут) при большем их количестве по сравнению с модификацией белкового изолята РП. При этом важно заметить, что белковый изолят, модифицированный РП, на электрофаретических спектрах представлен наиболее крупной фракцией на пике 16 площадью 25,9058 mAU×сек и заключительной фракцией, появляющейся на 29 минуте площадью 8,3365 mAU×сек. Остальные минорные фракции присутствуют в минимальных количествах — площадь их пиков колеблется от 0,0048 mAU×сек до 2,5118 mAU×сек. Хроматограмма белкового изолята, модифицированного ПМС, характеризуется рядом однотипных по конфигурации и абсолютной площади пиков, отличающимися от хроматограммы белков, модифицированных РП, наибольшей площадью, в пределах от 0,0440 mAU×сек до 5,5930 mAU×сек.
Заключительная фракция, появляющаяся на 19 минуте, имеет относительную площадь 0,15 %, причем для всех других описываемых хроматограмм площадь пика заключительной фракции выше и доходит до 21 %. На хроматограмме белкового изолята, модифицированного последовательно СиРП (рисунок 4), наблюдается наибольшее количество пиков и фракций, при одновременном уменьшении площади основных фракций и снижении времени их удерживания, что указывает на углубление гидролитических процессов.
Три пика высокомолекулярной фракции нативного белкового продукта при комплексной модификации дробятся на пять пиков, плотно идущих друг за другом, с сокращением времени выхода на 3 минуты. Первоначально характерны пики, имеющие пологий, сглаженный рельеф среднемолекулярной фракции нативного белкового продукта, после комплексной модификации, растительными и микробными протеазами, характерны вытянутые пики и выходят быстрее уже на 10 минуте против 13 минуты соответствующих пиков нативного белкового продукта.
Таким образом, под влиянием комплекса протеаз различного происхождения в белковом продукте появляется значительное количество глубоко гидролизованных белковых фракций, отличающихся от исходных меньшей молекулярной массой и измененным фракционным составом.
Источник: Молодой ученый |
